Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke Technik, die es Forschern ermöglicht, spezifische Moleküle und Strukturen in Zellen und Geweben sichtbar zu machen. Um Proben für die Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, werden häufig mit einem Kryostat-Mikrotom dünne Schnitte aus gefrorenem Gewebe geschnitten. In diesem Blogbeitrag werde ich einige Einblicke in die Verwendung eines Kryostat-Mikrotoms für die Fluoreszenzmikroskopie geben und dabei auf meine Erfahrung als Lieferant von Kryostat-Mikrotomen zurückgreifen.
Das Kryostat-Mikrotom verstehen
Ein Kryostat-Mikrotom ist ein Spezialinstrument zum Schneiden dünner Schnitte aus gefrorenem Gewebe bei niedrigen Temperaturen. Es besteht aus einer Schneidklinge, einem Probenhalter und einer temperierten Kammer. Die niedrige Temperatur trägt dazu bei, die Gewebestruktur zu erhalten und den Abbau fluoreszierender Moleküle zu verhindern.
Auf dem Markt sind verschiedene Arten von Kryostat-Mikrotomen erhältlich. Zum Beispiel dieKryotombietet präzise Schneidfunktionen, während dieKryostaten Halbautomatischbietet eine gute Balance zwischen Automatisierung und Benutzerkontrolle. UnserKryostat-Mikrotomkombiniert erweiterte Funktionen, um den unterschiedlichen Anforderungen von Forschern gerecht zu werden.
Vorbereitung des Kryostat-Mikrotoms
Bevor Sie das Kryostat-Mikrotom verwenden, ist es wichtig, das Instrument richtig vorzubereiten. Reinigen Sie zunächst die Schneidklinge und den Probenhalter, um eventuelle Rückstände und Verunreinigungen zu entfernen. Für eine gründliche Reinigung verwenden Sie eine geeignete Reinigungslösung und eine weiche Bürste.
Als nächstes stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer ein. Die ideale Temperatur hängt von der Art des zu schneidenden Gewebes ab. Im Allgemeinen ist eine Temperatur zwischen -18 °C und -25 °C für die meisten Gewebe geeignet. Lassen Sie den Kryostaten die eingestellte Temperatur erreichen, bevor Sie fortfahren.
Vorbereiten der Gewebeprobe
Die Qualität der Gewebeprobenvorbereitung ist entscheidend für eine erfolgreiche Fluoreszenzmikroskopie. Beginnen Sie mit der Fixierung des Gewebes in einem geeigneten Fixiermittel. Für die Fluoreszenzmikroskopie werden üblicherweise Fixiermittel wie Paraformaldehyd verwendet, da diese die Fluoreszenzsignale gut bewahren.
Nach der Fixierung sollte das Gewebe kryogeschützt werden. Dabei wird das Gewebe in eine Kälteschutzlösung wie Saccharose getaucht, um die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren zu verhindern. Das Gewebe wird dann in einem geeigneten Gefriermedium, beispielsweise einer OCT-Verbindung, eingefroren.
Anbringen des Gewebes am Probenhalter
Sobald das Gewebe gefroren ist, muss es auf dem Probenhalter montiert werden. Platzieren Sie den gefrorenen Gewebeblock vorsichtig auf dem Probenhalter und befestigen Sie ihn mit der entsprechenden Montagevorrichtung. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe zentriert und fest am Halter befestigt ist, um ein genaues Schneiden zu gewährleisten.
Einstellen der Schnittparameter
Stellen Sie vor Beginn des Schnittvorgangs die Schnittparameter am Kryostat-Mikrotom ein. Zu diesen Parametern gehören die Schnittdicke, die Schnittgeschwindigkeit und die Vorschubgeschwindigkeit. Die Schnittdicke hängt von der Gewebeart und den Anforderungen des Fluoreszenzmikroskopie-Experiments ab. Für die meisten Anwendungen ist eine Abschnittsdicke von 5 – 10 Mikrometer geeignet.
Die Schnittgeschwindigkeit und die Vorschubgeschwindigkeit sollten je nach Härte des Gewebes angepasst werden. Weicheres Gewebe erfordert möglicherweise eine langsamere Schnittgeschwindigkeit und eine geringere Vorschubgeschwindigkeit, während härteres Gewebe eine höhere Schnittgeschwindigkeit verträgt.
Schneiden des Gewebes
Sobald die Parameter eingestellt sind, starten Sie den Schneidevorgang. Bewegen Sie den Probenhalter langsam in Richtung der Schneidklinge. Während die Klinge das Gewebe durchschneidet, entstehen dünne Schnitte. Verwenden Sie einen feinen Pinsel oder einen Schnittheber, um die Schnitte vorsichtig auf einen Objektträger zu übertragen.
Es ist wichtig, vorsichtig mit den Abschnitten umzugehen, um Schäden zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte gleichmäßig auf der Folie verteilt sind und sich nicht überlappen.
Fluoreszierende Färbung der Schnitte
Nach dem Schneiden besteht der nächste Schritt darin, die Schnitte mit Fluoreszenzfarbstoffen anzufärben. Es stehen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe für unterschiedliche Anwendungen zur Verfügung, beispielsweise DAPI für die Kernfärbung und Alexa Fluor-Farbstoffe für die spezifische Proteinmarkierung.
Bereiten Sie die Färbelösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Inkubieren Sie die Schnitte für die entsprechende Zeit in der Färbelösung. Waschen Sie die Schnitte nach dem Färben gründlich, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
Montage der gebeizten Abschnitte
Sobald die Abschnitte gefärbt sind, müssen sie auf ein Deckglas montiert werden. Verwenden Sie ein geeignetes Eindeckmedium, das mit den Fluoreszenzfarbstoffen kompatibel ist. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums auf die gefärbten Abschnitte und senken Sie das Deckglas vorsichtig auf den Objektträger ab. Vermeiden Sie dabei die Bildung von Luftblasen.
Abbildung der Abschnitte
Schließlich sind die gefärbten Schnitte für die Fluoreszenzmikroskopie bereit. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung ein, um die Fluoreszenzsignale sichtbar zu machen. Verwenden Sie die entsprechenden Filter, um die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe zu erkennen.
Fehlerbehebung und Tipps
- Abschnittsqualität: Wenn die Abschnitte zerknittert oder eingerissen sind, überprüfen Sie das Schneidmesser auf Stumpfheit oder Beschädigung. Für die Herstellung qualitativ hochwertiger Schnitte ist eine scharfe Klinge unerlässlich.
- Fluoreszierendes Signal: Wenn das Fluoreszenzsignal schwach ist, überprüfen Sie das Färbeprotokoll. Stellen Sie sicher, dass die Färbedauer und die Farbstoffkonzentration angemessen sind. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Schnitte nicht zu stark gewaschen werden, da dies das Fluoreszenzsignal verringern kann.
- Temperaturkontrolle: Halten Sie während des gesamten Schneidevorgangs eine stabile Temperatur in der Kryostatkammer aufrecht. Temperaturschwankungen können die Qualität der Schnitte beeinträchtigen.
Kontakt für Kauf und Beratung
Wenn Sie Interesse am Kauf eines Kryostat-Mikrotoms für Ihre Fluoreszenzmikroskopie haben oder Fragen zur Verwendung haben, können Sie sich gerne an uns wenden. Unser Expertenteam unterstützt Sie gerne dabei, das richtige Instrument für Ihre Forschung zu finden.
Referenzen
- Histologie: Ein Text und Atlas von Michael H. Ross und Wojciech Pawlina.
- Fluoreszenzmikroskopie: Prinzipien, Techniken und Anwendungen von Richard P. Haugland.